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基质金属蛋白酶(MMP2/9)试剂盒,明胶酶谱法试剂盒

基质金属蛋白酶(MMP2/9)试剂盒,明胶酶谱法试剂盒

点击次数:453    发布时间:2016/1/25 10:57:39

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详细内容

基质金属蛋白酶(MMP2/9)试剂盒,明胶酶谱法试剂盒

本产品仅供科研实验,不得用于医疗或食用。 基质金属蛋白酶(mmp-2/9)试剂盒/明胶酶谱法试剂盒

 

描述:基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌,活化后能够降解 细胞外基质的胶原蛋白,又称胶原酶。通过影响细胞外基质,胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组 织重多疾血浆与组 MMP-2MMP-9 参与各种生理与病理过程,其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视   1

本试剂盒采用酶谱法(zymography)检测 MMP-2MMP-9  活性。Zymography  是一种广为使用的、基  SDS-PAGE 相凝蛋白酶其灵敏 1 nM ELISA  2  本原理和程序是:制备加有胶原酶底物的 SDS-PAGE 凝胶,含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电 泳, 电泳结束后取出凝胶与酶反应 Buffer 孵育,凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深  色背在有蛋带的酶将降胶中的 而形 同时指 MMP-2MMP-9 小位()剂盒

MMP-2MMP-9 蛋白物及学反缓冲,可测少 0.1~0.5 µl  MMP-2MMP- 9 酶谱及活性,检 测灵敏度~1 nM。试剂盒可进行 50 次标准小胶检测,如果小胶加样孔为 10~15

个,则总计可检测 500~750 个样品。


适用: 检测 MMP-2MMP-9 酶谱及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM)。 组成与储存 (50 assays)

  1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, ?20 ºC
  2. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 ºC

3. 10 × Buffer A, 50 ml, ºC, 使用时用蒸馏水稀释;

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用时用蒸馏水稀释;

5. SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(#P1501), 4 ºC

检测步骤:

1.  MMP 蛋白 SDS-PAGE 离胶浓 8% SDS- PAGE 凝胶。将 10 × substrate G 融化,并 90 ºC 加热 5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加  10 × substrate G 并使之稀释 10 倍,混匀后加入过硫酸铵和 TEMED,等待凝胶聚合。

2. 待测样品 1:1 稀释于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)接上切勿加变性并且 使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量,使用普通蛋白预染  Marker   即可。阳 性对照(可选步骤):可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血与 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等体积混合,取 5-15µl 上样。

3. 低电流恒流电泳,每一块小胶电流为 20    mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4. 凝胶取出器内水冲洗入  10    ml

 Buffer A(用蒸馏水稀释),室温漂洗凝胶 2 × 30 分钟。中间换液。

5.  孵育:倒掉 Buffer A加入 10 ml  Buffer B(蒸馏水稀释),室温或 37ºC 孵育 1~5 小时。阳性   MMP  37ºC  1  MMP 活性应延长育时 10 小时或 过一夜

6.  显色:倒掉 Buffer B,加入 SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(操作步骤见 SDS-PAGE  蛋白蓝染色说明书凝胶区域被深 MMP 带的 不被  MMP-2MMP-9 的大位置(酶谱) 活性。阳 性对照将在 66~72 (MMP-2)92 (MMP-9)130 (proMMP-9)225 (proMMP-9) kDa 位置出现透 明条带。

7. 条带扫描:将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 MMP 条带透明,但凝胶背景并非真正全黑。解决 办法调整显示设置为 色。MMP      条带则为白色,这种背景黑条带白的格式是英文论文中*常见的格式。

 

1. 10 mM 能够 EDTA 完全抑制 MMP 活性。

2. 凝胶干燥:可使用聚丙烯酰胺凝胶干胶装置(#P2000)室温快速干燥凝胶,作为永久记录保留。

 

参考文

  1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
  2. Heussen C, and Dowdle EB.Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem1980, 102, 196–202

 

 

 

SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书 P1501

 

 

常规考马斯亮蓝 SDS-PAGE 凝胶蛋白质染色是实验室常用的凝胶染色方法。银染方法虽然灵敏度 高,但所需试剂复杂并且有毒有害,操作步骤繁琐,难以控制获得好的染色效果。

 

 

染色步骤:

1. 液即为使用酰胺凝培养斯亮蓝 胶,并缓慢摇动 2h

2. 倾去染色液,用脱色液冲洗凝胶;

3. 以脱色液覆盖凝胶,缓慢摇动 2h,倾去脱色液,再加入新脱色液进行脱色,直至获得清晰的 蓝色的条带和干净的背景(通常此过程需要 24h,也可脱色过一夜至清晰的蓝色的条带和干净 

4. 对凝胶进行分析和照相,凝胶可放置在    7%的乙酸中保存。也可用凝胶干胶装置(P2000)对 凝胶进行处理后保存。

安全性:含有甲醇,无特殊毒性,按一般化学品操作规程处理。 说明:

1. 染色液配方:0.25g 考马斯亮蓝 R250 420ml 甲醇 100ml 冰乙酸,定容至 1000ml,混合 1h 后用 Whatman 1 号滤纸过滤,于室温可无限期保存;

2. 配方:::7:5:88V:V:V

3. 保存液:7%冰醋酸;

4. 凝胶染色之后,染色液可以回收利用,装入新容器内,室温或 4 ºC 保存,可反复使用 2-4 次。

更新时间:2024/6/25 16:44:59

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