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当前位置:南京信帆生物技术有限公司>产品中心>Western blot实验代做 > WB实验代测
点击次数：740 发布时间：2017/3/20 9:59:33
与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
western blot一般步骤：蛋白质抽提，蛋白质定量，变性聚丙稀酰胺不连续凝胶电泳（SDS-PAGE），蛋白质转移，western blot膜的封闭和抗体孵育，western blot结果检测，western blot数据分析，提供实验报告。
western blot服务内容：专业的队伍，提供完整的实验步骤和结果，提供专业的数据分析，提供电子版扫膜结果，以及灰度值分析。
Western blot样本要求
客户需新鲜或正确保存的蛋白样品， 检测目的蛋白的一抗（或由本公司代购）。样品要求为：
1、裂解样品总蛋白量>500ug/样品。
2、细胞样品总蛋白浓度>1mg/ml。
3、组织样品总蛋白浓度>10-15mg/ml。
Western blot结果及数据提供
内参蛋白和目的蛋白曝光胶片各一张，可提供扫描图，实验报告，包括整个试验流程所涉及的实验数据和实验步骤。如需进行蛋白纯化服务，将提供检测报告
WB实验代测
服务内容
我们提供从蛋白制备、蛋白电泳到Western blot检测的全流程服务，如需要还可进行灰度分析。
说明
1、建议提供目的蛋白阳性表达样品（纯蛋白或有阳性表达的细胞或组织）作为阳性对照。
2、每张膜检测1-8个样品。
3、如果一抗由客户提供，请在正确条件下保存，避免污染及反复冻融。
关于Western blot实验异常分析
『无信号』
| 原因 | 建议 |
| 一抗与二抗不匹配 | 选择针对一抗来源种属制备的二抗； |
| 一抗不识别目的的种属的蛋白 | 1)检查抗体的说明书，适用范围内是否包含目的种属 |
| 一抗或二抗不足，没有足够的抗体结合到目的蛋白 | 1)降低抗体稀释倍数，增加抗体浓度 |
| 封闭剂与一抗有交叉反应 | 改变封闭剂 |
| 抗原不足 | 1)每个泳道加入20-30ug总蛋白 |
| 在检测的组织内目的蛋白表达水平低 | 检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性，也可更换细胞系 |
| 蛋白转膜效率低 | 1)利用丽春红检测转膜效率;检查转移装置是否电极弄反 |
| 膜过渡洗涤 | 减少洗涤时间和强度 |
| 叠氮钠抑制二抗活性 | 二抗稀释液内不用叠氮钠 |
『没有特异条带』
| 原因 | 建议 |
| 细胞系传代过多后蛋白表达谱发送变化 | 1)使用未传代或传代次数较少的细胞系进行样品制备 |
| 蛋白本身有很多修饰 | 1)查阅文献，确定目的蛋白是否存在多种修饰 |
| 蛋白被消化或者降解 | 1)蛋白样品确保未被污染，确保含有蛋白酶抑制剂 |
| 所检测蛋白存在多种剪接体，导致分子量大小不同 | 1)查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA |
| 一抗或二抗浓度高 | 1)减低抗体浓度 |
| 洗涤不够 | 1)充分洗涤 |
『条带大小不正确』
| 原因 | 建议 |
| 目的蛋白被降解 | 确保蛋白样品未被污染，确保含有蛋白酶抑制剂 |
| 存在不同的剪接体 | 查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA |
| 重组蛋白 | 检测是否存在额外加入的蛋白 |
| 特殊蛋白如MDM2等 | 仔细阅读抗体说明书 |
尊敬的客户：
本公司有放射免疫技术服务、蛋白质组学服务、免疫组化、PCR技术服务、生物信息学数据分析等，如果您想了解Western blot的更多内容或者其他服务信息，您可以拨打本公司的服务热线了解更多产品的详细信息，至善至美的服务是我们永无止境的追求，欢迎新老客户放心选购自己心仪产品，我们将竭诚为您服务！
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更新时间：2024/1/3 11:50:32
