丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）试剂盒说明书
规格: 100 管/96 样
产品内容：
试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；
产品说明：
PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)
催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。
PDH 催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致600nm 光吸收的减少。
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式
离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研
钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本的前处理
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、称取约0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1mL 试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵
匀浆。
2、将匀浆600g，4℃离心5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PDH（此步可选做）。
5、在步骤4 的沉淀中加入200uL 试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，
超声3 秒，间隔10 秒，重复30 次），用于线粒体PDH 活性测定。
二、测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）在试剂五中加入19mL 试剂四充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min；
用不完的试剂4℃保存一周；
（2）在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 样本和190μL 试剂五，混匀，立即记录605nm 处
初始吸光值A1 和1min 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
三、PDH 活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g 组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=192×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH 活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.385×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：比
色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应
时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
