明胶酶谱法检测试剂盒使用小妙招

阅读次数：477 发布时间：2023/3/16 16:39:52

明胶酶谱法检测试剂盒使用小妙招

本试剂盒采用凝胶反相酶谱法(Zymography)检测MMP-2、MMP-9 活性及其无活性前体酶原谱系。Zymography 是一种广为使用的、基于SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制备含有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳时SDS与样本中的MMP可逆性结合，导致MMP氢键和疏水键破坏而不能发挥分解明胶的作用。电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育，MMP恢复活性，凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学反应缓冲液，可检测少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶谱及活性，检测灵敏度~1nM。试剂盒可进行25-50次标准小胶检测（如果样本MMP含量高，孵育时间短，不用换液可*多50次），如果小胶加样孔为10~15个，则总计可*多检测500~750个样品。

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MMP透明条带的大小、位置和酶谱的图例。注意因为样品未还原和加热变性，条带位置并不对应推算的蛋白分子量。下图1，正常血浆样品阳性对照可能出现的反相显示的透明条带位置：66kDa(MMP-2)，72kDa(proMMP-2)，87kDa(MMP-9)，92kDa(proMMP-9)，注意血浆中只有很少量的激活状态的66kDa的MMP2，增加上样量在ProMMP2下面隐约可见(*右侧泳道)。

不同于正常血浆MMP酶谱，每种组织样品(如牙周膜韧带组织)都具有自己特定的MMP活性酶谱，部分proMMP9(92kDa)可能会结合一个25kDa微球蛋白形成MMP9复合物，条带位置约125-130kDa，其二聚体条带大约在215-225kDa位置(图中并未显现)，多聚体条带位置240kDa，严格说他们都是MMP9复合体，但也有人称其为proMMP-9。注意在这种组织activeMMP9活性低，但activeMMP2活性高，与血浆MMP活性酶谱形成了鲜明的对比

条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中*常见的格式。

常规考马斯亮蓝SDS-PAGE 凝胶蛋白质染色是实验室常用的凝胶染色方法。银染方法虽然灵敏度高，但所需试剂复杂并且有毒有害，操作步骤繁琐，难以控制获得好的染色效果。

染色步骤：

1. 此染色液即为工作液，使用时直接将聚丙烯酰胺凝胶放在培养皿中以考马斯亮蓝染色液覆盖凝

胶，并缓慢摇动2h；

2. 倾去染色液，用脱色液冲洗凝胶；

3. 以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动2h，倾去脱色液，再加入新脱色液进行脱色，直至获得清晰的蓝色的条带和干净的背景（通常此过程需要2～4h，也可脱色过夜至清晰的蓝色的条带和干净的背景）；

4. 对凝胶进行分析和照相，凝胶可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝胶干胶装置对凝胶进行处理后保存。